E torniamo alle origini (del SARS-CoV-2)

La questione dell’origine del SARS-CoV-2 sembrava ormai un argomento per pochi appassionati. Ma mentre la comunità scientifica si confrontava con evidenze recenti che confermerebbero l’origine della pandemia nel mercato di Huanan a causa della presenza di animali vivi infetti (discussione aperta in corso), in Italia un’intervista del Corriere della Sera al presidente dell'AIFA, Giorgio Palù, si racconta di nuove prove a favore dell'origine del virus nel laboratorio di virologia di Wuhan (WIV), suscitando molta curiosità  e incoraggiando forse qualcuno a fare collegamenti non opportuni a causa della concomitanza delle notizie sui presunti laboratori controllati dagli americani in Ucraina in cui si produrrebbero armi biologiche. Addirittura, come riportato da alcune fonti, lavorando anche su coronavirus di pipistrello. Per cui forse è utile fare un po’ di chiarezza.

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Per chi ha fretta o non ha voglia di leggere, si sta parlando di un’ipotesi estremamente improbabile e forzata.

Nell'articolo del Corriere della Sera leggiamo che: nella proteina Spike di SARS-CoV-2 c'è una piccola sequenza (19 lettere) presente anche in un gene umano e si trova solo li. La piccola sequenza è quella ormai nota che codifica per il sito di taglio della furina favorendo l'infezione del virus. E proprio la sua provenienza da un gene umano parrebbe dimostrare che il virus progenitore di SARS-CoV-2 sia stato coltivato in cellule umane in un laboratorio, abbia ricombinato con il gene e poi i ricercatori se lo siano fatto sfuggire accidentalmente. 

Nell’intervista si specifica che si sarebbe trattato di un incidente nel corso di ricerche svolte "a fin di bene". Puntualizzazione necessaria per prendere le distanze dai fautori del virus creato come arma biologica. Il resto sono due anni di pandemia e 6 milioni di morti.

Più di questo il quotidiano non dice (ma perché un quotidiano non può fare divulgazione scientifica un po' più seria?), per capire bisogna leggere l'articolo a cui fa riferimento Palù nell'intervista, di cui è coautore, e in cui viene descritta in dettaglio la pistola fumante che inchioderebbe il laboratorio di Wuhan.

Cosa dice l'articolo di Palù

Per leggerlo occorre capirne un po' di biologia molecolare, di virologia, di bioinformatica e di biologia evoluzionistica. Per cui ho pensato di fare una lettura guidata.

Nell’articolo gli autori spiegano di aver trovato non l'elemento essenziale di 12 nucleotidi (quelli che codificano la sequenza prolina arginina arginina alanina che la proteasi furina riconosce) ma addirittura uno più esteso, di 19 nucleotidi conservati al 100% nella sequenza di un gene umano chiamato MSH3. Che è un gene coinvolto nel controllo e nella riparazione del DNA tramite un sistema noto come Mismatch Repair (MMR). È un sistema specializzato nel riconoscimento e la rimozione dei nucleotidi inseriti nel DNA in modo sbagliato, che se non rimossi darebbero luogo a mutazioni. 

Ma di fatto quei 19 nucleotidi non si trovano nel gene MSH3 (che è presente in tutte le cellule umane) quanto in una sequenza modificata di quel gene e brevettata da Moderna nel 2016 per studi nel campo della terapia oncologica (SEQ ID11652, US patent 9,587,003). Rispetto al gene MSH3 originale la sequenza brevettata da Moderna ha diverse mutazioni mirate a rendere più efficiente la sua produzione (si definisce “ottimizzata”) nel caso venisse introdotta ed espressa in cellule umane. Quindi la sequenza del gene e quella modificata da Moderna non sono uguali.

Inoltre, quella sequenza non si trova nemmeno nel gene MSH3 modificato da Moderna, la troviamo infatti solo se la leggiamo al contrario. Se fosse un testo, come se leggessimo una parola da destra verso sinistra, trattandosi di DNA si dice in modo invertito e complementare. Questo vuol dire che non esiste un gene umano in cui sia presente il sito di taglio per la furina che poi ritroviamo in SARS-CoV-2, si tratta di un ritrovamento casuale in una sequenza modificata.

Questo tecnicamente non sarebbe un problema per l'ipotesi. Ma nel momento in cui tanta discussione sull’origine del sito di taglio della furina nasce dal fatto che non è presente nei coronavirus più affini a SARS-CoV-2 come RaTG13 e che le due arginine del sito sono codificate da due triplette CGG CGG non frequenti nei coronavirus, sostenere che nel gene MSH3 umano ci sia il sito di taglio per la furina che poi si ritrova in SARS-CoV-2 non è corretto. Nel gene MSH3 non c'è un sito di taglio per la furina, e quei nucleotidi non codificano niente perché sono nell'orientamento sbagliato. Letti nell'orientamento giusto codificano per altro.

Il punto critico però è che quella sequenza di 19 nucleotidi non esiste nel gene MSH3, esiste solo, per motivi assolutamente casuali, in una sequenza modificata e brevettata.

Continuando a leggere, a questo punto gli autori fanno l'ipotesi che nei laboratori del WIV si stessero crescendo virus SARS-like in cellule umane per motivi di studio e sperimentazione, e che nel corso della replicazione del suo genoma uno di questi virus (che quindi sarebbe il progenitore di SARS-CoV-2) avrebbe accidentalmente ricombinato l'RNA del suo genoma con quello del gene che contiene il sito di taglio della furina.

Cosa bisogna sapere per capire questo passaggio: i virus a filamento singolo di RNA come SARS-CoV-2 replicano il proprio genoma trascrivendo con la loro RNA polimerasi (l’enzima che copia e sintetizza un filamento nuovo di DNA o RNA) un filamento complementare provvisorio, definito "filamento negativo". Quel filamento poi servirà come stampo per la polimerasi virale per trascrivere nuove copie del filamento positivo che saranno assemblate con le proteine del capside per fare nuove particelle virali in grado di infettare.

Può capitare però che la RNA polimerasi del virus mentre sta copiando il filamento negativo si stacchi accidentalmente e si riattacchi (si chiama template switching, scambio del templato). A questo punto possono succedere diverse cose: la polimerasi si può riattaccare dov'era e non succede niente, si può riattaccare in un punto diverso del filamento che stava copiando, si può riattaccare su un altro filamento di RNA del virus, si può riattaccare sull'RNA di un virus diverso che abbia coinfettato la cellula. In questi casi il risultato sarà un genoma virale con delezioni o duplicazioni, oppure con inserimenti di sequenze esogene. Il meccanismo si chiama Copy-Choice recombination e serve al virus per creare variabilità genetica.

In questo caso però gli autori fanno l'ipotesi che la polimerasi virale si sia staccata dal filamento negativo che stava trascrivendo, si sia riattaccata all'RNA di un gene umano presente nella cellula per copiarne 19 nucleotidi e poi abbia ripreso a copiare il suo RNA originale. Il risultato è l'inserimento dei 19 nucleotidi che contengono il sito di taglio per la furina nella sequenza di SARS-CoV-2.

Le criticità dell’ipotesi dell’articolo del prof. Palù

Questa ipotesi però presenta alcuni problemi.

Il primo è che i 19 nucleotidi non sono presenti nell’mRNA del gene MSH3 presente in tutte le cellule umane ma solo nella sequenza di un suo clone modificato da Moderna. Quindi si sta facendo l'ipotesi che i ricercatori del WIV avrebbero infettato con dei coronavirus ottenuti da pipistrello cellule in cui era stato precedentemente inserito un gene MSH3 modificato per ricerche in campo oncologico.

E allora si pongono alcune domande. Il  WIV, che è un laboratorio di virologia, un laboratorio specializzato in virus SARS, stava facendo ricerche in campo oncologico? Le stava facendo per conto di o in collaborazione con Moderna? Avevano linee cellulari tipicamente usate per crescere virus trasdotte con un gene MSH3 brevettato da Moderna? E perché avrebbero usato quelle cellule per crescere dei coronavirus sconosciuti, al di fuori di ogni disegno sperimentale razionale?

Senza una risposta a queste domande l'ipotesi di copy-choice recombination con il gene MSH3 di Moderna proposta è niente più che un esercizio mentale.

Un altro problema è che la replicazione dei virus a singolo filamento di RNA crea un intermedio di RNA a doppio filamento (negativo/positivo) che le cellule riconoscono molto bene come pericolo tramite dei recettori cellulari specifici e distruggono rapidamente. È vero che la contromossa dei virus è cercare di neutralizzare quelle difese della cellula, ma in effetti la replicazione virale in genere avviene in ambienti compartimentati della cellula che i virus si creano appositamente per rimanere nascosti e protetti. Quali sono le possibilità che un mRNA cellulare possa trovarsi in uno di questi compartimenti di replicazione virale?

A questo punto inoltre l'articolo diventa poco chiaro e gli autori si avventurano a ipotizzare un ruolo del Mismatch Repair nella ricombinazione tra l'RNA del virus e il gene MSH3 modificato. Il problema è che il Mismatch repair lavora solo sul DNA, non sull'RNA. Quindi non è pensabile che sia coinvolto nella ricombinazione di un virus.

Un ultimo aspetto è se quella sequenza di 19 nucleotidi  sia veramente unica e impossibile da trovare in natura eccetto che nel gene MSH3 di Moderna, come sostengono gli autori. Vorrebbe dire che le probabilità che si crei in modo naturale una sequenza come quella in un virus sono veramente trascurabili. Ma su questo ha già scritto Enrico Bucci insieme a Marco Gerdol che in un breve articolo ci dicono che non è vero, quella sequenza si trova tranquillamente, il che non è così strano considerando che ci sono solo 4 nucleotidi per codificare tutto quello che esiste in natura.

Tutti questi aspetti, prettamente tecnici, rendono il gene MSH3 una pistola fumante decisamente poco convincente. Quindi, in base a questo articolo, non ci sono prove nuove a favore dell’ipotesi dell’origine di SARS-CoV-2 in un laboratorio. 

A questo punto sarebbe interessante fare due considerazioni spostandosi su un piano diverso.

La sequenza misteriosa

La prima è che forse non è corretto pretendere di trovare da qualche parte, in natura o in un laboratorio, quella "sequenza misteriosa", quei 12 nucleotidi col sito di taglio della furina già pronti e funzionali. Passata infatti la prima ondata di rivelazioni decisamente cospirazioniste secondo le quali il nuovo coronavirus era stato creato in un laboratorio militare cinese come arma biologica, in molti si sono concentrati sui 12 nucleotidi che codificano per il sito di taglio della furina come la prova più solida che il virus fosse comunque stato modificato in un laboratorio nel corso di esperimenti di Gain of Function perché non è possibile che un sito funzionale proprio con quella sequenza si crei da solo.

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Questo ragionamento non è tanto diverso dalla vecchia analogia dell'orologiaio di William Paley (se c'è un'orologio c'è un orologiaio che lo ha costruito) o meglio di quella dell'occhio usata un tempo da quei creazionisti che consideravano il nostro occhio come la prova evidente della creazione divina perché ad un oggetto che noi vediamo tanto complesso e perfetto, non si poteva arrivare per i passaggi graduali e casuali con cui funziona l’evoluzione. Ovviamente quella era un'affermazione basata sulla non conoscenza, la storia evolutiva dell'occhio inizia più di 500 milioni di anni fa, e  nel mondo animale ci sono tante forme alternative al nostro occhio, alcune molto rudimentali, semplici sensori di luce o di movimento, altre semplicemente diverse dall'occhio umano ma più adatte alle necessità di una mosca, o di un rapace. Il nostro occhio non è "più perfetto" di quello di un'aquila, è solo più adatto al modo in cui noi viviamo. Inoltre, una planaria grazie anche solo a dei fotorecettori, che sono decisamente più rudimentali rispetto al nostro occhio, può comunque sapere come muoversi e in che direzione andare. 

Analogamente, un’inserzione casuale di 12 nucleotidi nella sequenza di un virus non deve necessariamente dare un vantaggio straordinario, e nemmeno avere una funzione particolare. Basta che non influisca negativamente sulla stabilità e la funzione della proteina. Per esempio nella Spike di SARS-CoV-2 oltre ai 12 nucleotidi del sito di taglio della furina ci sono altre tre inserzioni che mancano nella Spike di Sars-CoV, il virus della SARS del 2003. Sono le quattro inserzioni che spinsero dei bioinformatici un po' superficiali a cercarle nel genoma di HIV, trovarle e far partire un’ondata di cospirazionismo sul virus creato in laboratorio ricombinato con HIV.

In effetti quelle quattro piccole sequenze si trovano in modo casuale  anche nel genoma di diversi animali in cui non hanno alcuna funzione particolare. È successo che una delle quattro in SARS-CV-2 abbia una sequenza che la rende funzionale, le altre tre no, eppure ci sono ma nessuno si chiede il perché. Ma a quella sequenza si può essere arrivati gradualmente, per mutazioni casuali successive a partire da una che non conteneva un sito di taglio per la furina.

Quando leggiamo del sito di taglio per furina di SARS-CoV-2 dovremmo sapere che la presenza di sequenze che hanno un ruolo funzionale specifico è normale in tutte le macromolecole, dai virus ai batteri ai nostri neuroni. Sono presenti nelle proteine per consentirne il taglio, l’attivazione, la degradazione. Sono presenti nel DNA per regolarne e controllarne l’attività in modo specifico per una cellula o un tessuto. Nella regione di regolazione di un gene ce ne possono essere decine, piccole sequenza specifiche di pochi nucleotidi che vengono lette e riconosciute da effettori specifici in grado di riconoscerle. Ma ovviamente non pensiamo che qualcuno le abbia disegnate e inserite nel nostro DNA. Non pensiamo che fossero così “da sempre”. Ci hanno accompagnato nel corso della nostra evoluzione, si sono formate e modificate con noi. E ora sono siti che fanno sì che un gene venga espresso in una cellula del fegato ma non in un neurone, che una proteina vada a finire nel nucleo o invece nel mitocondrio. O che venga tagliata dalla furina. Ognuno di essi ha una funzione importante, ma non stiamo a chiederci come ognuno di essi “sia finito” proprio in quella regione, con quella sequenza.

Va detto poi che il sito di taglio per la furina di SARS-CoV-2 così com'è non è nemmeno ottimale. Tanto è vero che alcune mutazioni nelle variante delta lo hanno reso più efficiente. L'evoluzione è un processo continuo, un gioco tra i cambiamenti casuali e la selezione naturale. L'orologiaio c'è, è cieco, ma fa degli orologi molto precisi.

Il salto di specie

L'altra considerazione è che se è vero che gli spillover sono eventi naturali, sono il modo in cui i virus usano la loro scarsa stabilità genetica per espandere la loro riserva di specie infettabili, sono anche eventi difficili da caratterizzare. È successo con HIV, succede di continuo con Ebola. Nessuno sta li a vedere quando e dove avviene il salto di specie. Lo capisci solo dopo, quando vedi un nuovo virus diffondersi nella popolazione.

Per esempio, oggi sappiamo che il virus HIV nelle sue due forme 1 e 2 è passato all'uomo diverse volte, forse una dozzina (non considerando quelle di cui non sappiamo perché non è andato avanti), due delle quali hanno avuto maggiore successo e hanno originato i ceppi oggi più diffusi. Il primo evento di spillover è datato tra gli anni '10 e '30 del 1900. La prima infezione diagnosticata, in modo postumo, è un campione del 1959. Ma l'epidemia vera e propria esplose negli anni '80.

Cosa ha fatto quel virus per tanti anni? Il suo percorso (dal sangue di una scimmia alla diffusione epidemica 50-70 anni dopo) è una combinazione di eventi e di fattori che non siamo in grado di ricostruire. Eppure non abbiamo preteso di avere in mano il virus progenitore, il virus zero, per sapere che HIV aveva fatto un salto di specie, e capire da dove provenisse. Oltretutto, se qualcuno nel 1981 avesse preteso (come stiamo facendo oggi con SARS-CoV-2) di trovare in una scimmia infetta da SIV (il virus di immunodeficienza delle scimmie) un virus tanto simile all’HIV da permettere di identificarlo come il virus di origine, lo avrebbe trovato? Se pensiamo che il progenitore comune era esistito 50-70 anni prima, ognuno faccia le sue considerazioni. 

Ma per qualcuno non riusciamo a trovare il progenitore comune del nuovo coronavirus perché quel virus è in una provetta in un laboratorio. Considerando che un'identità di sequenza del 97% con un coronavirus di pipistrello non ci basta, e il fatto che sequenziando milioni di genomi abbiamo visto SARS-CoV-2 accumulare mutazioni in soli due anni, perché anche il suo progenitore nel pipistrello o nel furetto non dovrebbe essere mutato, in un tempo che non sappiamo definire? Dobbiamo considerare l’ipotesi che stiamo cercando un virus che ormai non esiste più.

Tutto questo non esclude nessuna possibilità sulle origini di SARS-CoV-2, per le quali ad oggi è possibile solo fare delle ipotesi. Ma è importante capire quali ipotesi siano ragionevoli e quali no. Ed è importante capire che, come ci ha insegnato l’HIV, le vie e i tempi di un salto di specie in natura non sono necessariamente quelli raccontati in un programma televisivo.

Immagine in anteprima: PixxlTeufel via pixabay.com